文章摘要
张雅星,王滨,柳学周,徐永江,史宝,姜燕,崔爱君,张正荣,孙冉冉.半滑舌鳎两种leptin基因的体外重组表达和生物活性分析[J].水产学报,2019,43(11):2279~2289
半滑舌鳎两种leptin基因的体外重组表达和生物活性分析
Recombinant expression and bioactivity analysis of two leptin genes of Cynoglossus semilaevis
投稿时间:2018-12-27  修订日期:2019-05-28
DOI:10.11964/jfc.20181211598
中文关键词: 半滑舌鳎  leptin  原核表达  生物活性
英文关键词: Cynoglossus semilaevis  leptin  prokaryotic expression  bioactivity analysis
基金项目:山东省重点研发计划(2018GHY115044);山东省支持青岛海洋科学与技术试点国家实验室重大科技专项(2018SDKJ0303-1,2018SDKJ0501-2);中国水产科学研究院基本科研业务费专项(2019GH15);海水鱼产业技术体系专项(CARS-47);农业农村部“一带一路”沿线热带国家水产养殖科技合作项目
作者单位E-mail
张雅星 中国水产科学研究院黄海水产研究所, 农业农村部海洋渔业可持续发展重点实验室, 青岛市海水鱼类种子工程与生物技术重点实验室, 山东 青岛 266071
青岛海洋科学与技术试点国家实验室, 海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室, 山东 青岛 266071
上海海洋大学水产与生命学院, 上海 201306 
 
王滨 中国水产科学研究院黄海水产研究所, 农业农村部海洋渔业可持续发展重点实验室, 青岛市海水鱼类种子工程与生物技术重点实验室, 山东 青岛 266071
青岛海洋科学与技术试点国家实验室, 海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室, 山东 青岛 266071 
 
柳学周 中国水产科学研究院黄海水产研究所, 农业农村部海洋渔业可持续发展重点实验室, 青岛市海水鱼类种子工程与生物技术重点实验室, 山东 青岛 266071
青岛海洋科学与技术试点国家实验室, 海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室, 山东 青岛 266071 
 
徐永江 中国水产科学研究院黄海水产研究所, 农业农村部海洋渔业可持续发展重点实验室, 青岛市海水鱼类种子工程与生物技术重点实验室, 山东 青岛 266071
青岛海洋科学与技术试点国家实验室, 海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室, 山东 青岛 266071 
xuyj@ysfri.ac.cn 
史宝 中国水产科学研究院黄海水产研究所, 农业农村部海洋渔业可持续发展重点实验室, 青岛市海水鱼类种子工程与生物技术重点实验室, 山东 青岛 266071
青岛海洋科学与技术试点国家实验室, 海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室, 山东 青岛 266071 
 
姜燕 中国水产科学研究院黄海水产研究所, 农业农村部海洋渔业可持续发展重点实验室, 青岛市海水鱼类种子工程与生物技术重点实验室, 山东 青岛 266071
青岛海洋科学与技术试点国家实验室, 海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室, 山东 青岛 266071 
 
崔爱君 中国水产科学研究院黄海水产研究所, 农业农村部海洋渔业可持续发展重点实验室, 青岛市海水鱼类种子工程与生物技术重点实验室, 山东 青岛 266071
青岛海洋科学与技术试点国家实验室, 海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室, 山东 青岛 266071
上海海洋大学水产与生命学院, 上海 201306 
 
张正荣 中国水产科学研究院黄海水产研究所, 农业农村部海洋渔业可持续发展重点实验室, 青岛市海水鱼类种子工程与生物技术重点实验室, 山东 青岛 266071
青岛海洋科学与技术试点国家实验室, 海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室, 山东 青岛 266071
上海海洋大学水产与生命学院, 上海 201306 
 
孙冉冉 中国水产科学研究院黄海水产研究所, 农业农村部海洋渔业可持续发展重点实验室, 青岛市海水鱼类种子工程与生物技术重点实验室, 山东 青岛 266071
青岛海洋科学与技术试点国家实验室, 海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室, 山东 青岛 266071 
 
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中文摘要:
      根据半滑舌鳎lepalepb编码氨基酸序列合成开放阅读框ORF肽段。利用原核表达载体pEQ30成功构建了半滑舌鳎lepa/pQE30和lepb/pQE30重组质粒,分别转化至大肠杆菌M15后,经IPTG诱导获得了N端含6个组氨酸的半滑舌鳎LepA和LepB重组蛋白。获得的重组蛋白大小均为16 ku,37 ℃下用0.5 mmol/L的IPTG诱导4 h后目的蛋白表达量最高,主要以包涵体形式存在。检测半滑舌鳎LepA和LepB重组蛋白浓度分别为0.3和0.25 mg/mL。Western blot免疫印迹和质谱分析表明,获得的LepA和LepB重组蛋白均具有免疫活性且序列正确。Ni2+-NTA亲和层析柱纯化可获得高纯度的半滑舌鳎LepA和LepB重组蛋白。离体孵育实验表明,获得的半滑舌鳎LepA和LepB重组蛋白能显著抑制半滑舌鳎下丘脑lepalepbgnrh3 mRNA的表达水平,表明获得的重组蛋白具有明显的生物活性。研究结果可为探究leptin在半滑舌鳎生长发育中的调控机制提供重要参考。
英文摘要:
      The peptides encoding ORF domains were synthesized based on the amino acid sequence of lepa and lepb from Cynoglossus semilaevis. The prokaryotic expression vector pEQ30 was used to construct the recombinant plasmids of lepa/pQE30 and lepb/pQE30, which were transformed into Escherichia coli M15 strains and then induced by IPTG to obtain the recombinant proteins of LepA and LepB containing 6 His at the N-terminus. The obtained LepA and LepB polypeptides expressed in form of inclusion bodies had molecular weight of both 16 ku, and the optimum condition for the highest expression of the target proteins were induction by 0.5 mmol/L IPTG at 37 ℃ for 4 hours. The concentrations of LepA and LepB recombinant proteins in tongue sole were 0.3 mg/mL and 0.25 mg/mL, respectively. The results of Western blot and mass spectrometry analysis indicated that the obtained recombinant proteins of LepA and LepB had correct sequences and immunological activity. The proteins were purified by Ni2+-NTA affinity chromatography, and high-purity recombinant proteins of LepA and LepB were obtained. In vitro incubation of hypothalamus with recombinant LepA and LepB proteins from C. semilaevis indicated that they could significantly inhibit the expression of endogenous lepa, lepb and gnrh3 mRNA, which verified that the obtained recombinant proteins have biological activities. The results could help exploration of the physiological role and regulation mechanism of leptin in growth and development of C. semilaevis.
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